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Herramientas de alto rendimineto

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En el proyecto AQUAGENET se han aplicado varias tecnologías NGS de segunda generación para distintas aplicaciones en función de la especie. Las tecnologías NGS de segunda generación se caracterizan por requerir un paso de amplificación clonal previo a la secuenciación. Los principales tipos son las tecnologías de pirosecuenciación o 454, SOLiD e Ion torrent que utilizan una PCR en emulsión y la tecnología Illumina que se basa en una PCR en puente. Estas cuatro plataformas difieren en las químicas de detección, rendimientos y costes (más información en la sección Documentos). 
 
Cada tecnología NGS posee una serie de ventajas y desventajas pero de forma general, la plataforma Illumina es la que presenta un mayor rango de utilidades por su menor coste por lectura y el gran volumen total de información de alta calidad generado. Esta plataforma se utiliza frecuentemente para estudios de expresión génica tipo RNA-seq, resecuenciación de genomas, estudios de marcadores SNPs y biomarcadores. Para ensamblajes de novo de transcriptoma y genoma es la tecnología 454, por la mayor longitud de las lecturas, la más utilizada. En la siguiente tabla se indican las principales tecnologías aplicadas en AQUAGENET por especie y grupo.
 
 
   
Tecnologías NGS desarrolladas en el proyecto AQUAGENET.  
 
Grupo
Especies
Beneficio
NGS
Organo/tejido
Aplicación
 Peces
S. solea
IFREMER
Illumina
Larvas y embriones
RNA-seq para mejora de calidad larvaria.
S. senegalensis
UB
454
Gónadas y cerebro
Transcriptómica para control de reproducción.
IFAPA
454, Illumina
Larvas y embriones ADN genómico
RNA-seq para mejora de calidad larvaria. Secuenciación de Novo de Genoma.
UCA
454
BACs
Mapeo. Secuenciación de Novo de Genoma.
Moluscos
M. galloprovincialis
CNRS
Illumina, 454
BACs, ADN genómico
Genética de poblaciones e identificación de especies.
Crassostrea gigas
IFREMER
Illumina
ADN genómico
Selección genética e identificación de especies.
Crassostrea angulata
UCA
Solid
ADN genómico
Diferenciación de especies.
Ruditapes decussatus
IPMA
Illumina
Varios tejidos
Transcriptómica para marcadores.
Patógenos 
P. damselae piscicida
IFAPA
454
ADN genómico
Secuenciación de Novo de Genoma
Herpesvirus
IFREMER
454
ADN genómico
Secuenciación de Novo de Genoma
Bonamia
IFREMER
Illumina
ARN total
Transcriptómica para marcadores.

 
La aplicación de las tecnologías NGS ha permitido incrementar enormemente la disponibilidad de recursos genómicos disponibles para estas especies de interés acuícola en el espacio SUDOE. Así, en  el caso del lenguado, ya está disponible la SoleaDB  en la sección Bases de Datos, que incluye parte de la información generada para S. senegalensis en el proyecto. En esta tarea han estado implicados 4 socios del proyecto y hasta el momento se han realizado tres ensamblajes del transcriptoma de S. senegalensis y que incluye un total de 3.379.685 secuencias (SoleaDBv3). El análisis bioinformático ha permitido obtener 252.416 unigenes con una longitud media de 336 nucleótidos. Además se han identificado miles de marcadores tipo SNP y microsatélite para su implementación de planes de selección, de genética de poblaciones y evolutivos.
 

Marcadores disponibles en la SoleaDBv3
 
 
SNPs
Microsatélites
Total
430.570  
 
30.918
Unigenes con marcador
84.240  
Dinucleótidos
10.291
Trinucleótidos
12.623
Tetranucleótidos
8.004
Media por Unigene
5,1
 
1,1
 
La información genómica disponible en lenguado ha permitido el diseño y desarrollo de herramientas de alto rendimiento en dicha especie. La SoleaDBv3 contiene 252.416 unigenes de los que 53.930 genes están anotados Blast2go, Autofact o Full-lengher, así como 1.205 enzimas identificados con código EC y 145 rutas KEGGs. A partir de esta información, y tal como se describe en la siguiente sección, se ha creado un panel de genes de 44.000 genes con distintas funciones celulares en sentido directo para poder diseñar herramientas de alto rendimiento. De esta forma, se han diseñado de 2 tipos de herramientas tipo array: a) Un microarray con un formato de 4x44k sondas de hibridación y b) Tres herramientas openarray basadas en qPCR para el estudio del sistema inmune, endocrino, estrés y osmorregulación. Estas técnicas son, junto al RNA-seq (Basado en NGS), las más avanzadas para el estudio de expresión génica, permitiendo el avance más rápido en los estudios aplicados al desarrollo de la acuicultura. Las principales características de estas herramientas se muestras en la siguiente tabla.
 
 
Diferencias entre las técnicas para el estudio de expresión génica utilizadas en el proyecto AQUAGENET.
 
 
RNA-seq
Microarray
Openarray
Rango dinámico.(Órdenes de magnitud)
5
3
7-8
Precio
Alto
Intermedio
Bajo
Genes analizados
Transcriptoma completo y ediciones de los transcritos.
Transcriptoma completo.
Sólo 50-100 genes para estudios de expresión.
Sondas
No requiere diseño ni conocimiento previo de secuencias.
Limitaciones en la disponibilidad de secuencias, diseño y dirección de sondas.
Limitaciones en diseño y disponibilidad de secuencias.
Sensibilidad
Alta y bajo background.
Baja y alto background.
Muy alta y bajo background.
Especificidad
Muy alta.
Depende de la plataforma.
Muy alta.
Herramientas informáticas
En desarrollo.
Bien desarrolladas.
Muy fácil de aplicar.
Preparación muestras
Complicada. Requiere preparación de librerías específicas.
Fácil.
Fácil.
Tiempo
Días-semanas
Días
Horas
 
 
 
Panel de genes.
 

 fig_microarray_peq

Ampliar imagen

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Las tecnologías NGS generan millones de secuencias al azar. Por ello, necesario filtrar, anotar e identificar aquella información relevante para ser capaces de convertirla en un producto final de aplicación. La identificación de paneles de genes tiene por objetivo el de facilitar la búsqueda de genes de interés productivo.
 
Así para el lenguado, a partir de los 252.416 unigenes se seleccionó un panel de 44.000 genes que han sido la base para el diseño de herramientas. En la siguiente figura, se muestra la estrategia seguida para seleccionar los genes de interés y su orientación. La estrategia fue diseñada por Universidad de Málaga (Dr M. Gonzalo Claros) y se basa en un proceso de filtrado predictivo usando el software Full-LengtherNext. De esta forma, se persigue seleccionar los genes más probables minimizando la redundancias. Esquema de Procedimiento de selección de genes para su implementación en microarray
 
La información relativa a este panel se puede descargar en el siguiente link: Panel-44k. En dicho fichero se indica el nombre de la secuencia y código de la SoleaDB y su descripción según lo determinado por AUTOFACT y Blast2GO. En este documento también se indican la información de Gene Ontology a nivel celular (C), Molecular (M) y P para facilitar la identificación de su función. También se indican la clasificación KEGG según lo anotado por AUTOFACT y B2G. 
 
A partir de esta información se han diseñado las siguientes herramientas biotecnológicas de análisis de alto rendimiento. No obstante, para cada gene se podrá obtener mucha información en las Base de Datos específicas para cada especie utilizando el identificador específico.

 
  
 
   
 
 
 
socios aquagenet 16may12