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Herramienta tipo microarray

A finales de la década de los 90 aparecieron los primeros ensayos basados en tecnología de microarrays ante la necesidad de disponer de herramientas de alto rendimiento que permitieran evaluar respuestas celulares globales. Estas herramientas permite estudiar el complemento transcriptómico de una célula, tejido y órgano para el correcto desarrollo y funcionamiento del organismo. Cualquier cambio o alteración en la expresión de los genes se puede asociar a una enfermedad o alteración de una condición fisiológica. De esta forma, los microarrays se ha convertido en una herramienta muy útil para evaluar la expresión de miles de genes y sus implicaciones biológicas.
 
Técnicamente los microarrays consisten en soportes rígidos a los que se anclan miles de sondas de ADN y que permiten estudiar distintas características de los genes mediante hibridación. Sus aplicaciones son similares a las NGS, tales como de polimorfismos (SNPs, identificación de especies), análisis de expresión génica, estructura de la cromatina (ChIP-chip) o estructura cromosómica (arrays CGH).
 
En el caso del lenguado se ha desarrollado un microarray con un formato 4x44k para estudios expresión génica. Para su diseño se realizaron las siguientes etapas:
 
a) Selección de un panel de genes. Tal como se describe en Herramientas, se desarrolló un algoritmo específico que permitió identificar 44.000 genes probables codificantes en orientación directa. Esta etapa es clave en el diseño, ya que al ser una técnica de hibridación, se requiere conocer la orientación de los unigenes.  De otra forma, se produciría un fallo de hibridación. Por otro lado, dado que el número de unigenes era muy elevado (252.416 en SoleaDBv3), era necesario filtrar las secuencias y evitar al máximo las redundancias. Por tanto, el algoritmo desarrollado supone un nuevo avance en la gestión y manejo de NGS.
 
b) Clasificación de unigenes. Los unigenes se clasificaron en 8 categorías: KEGGs_AUTOFACT, KEGGs_B2G, GO_Term_F, GO_Term_P, GO_Term_C, Unassigned proteins, AUTOFACT_Annotated y Non_annotated según la información disponible de AUTOFACT y Blast2Go. El número total de unigenes en cada categoría se indica en la tabla adjunta y oscilaron entre 885 y 12.561.

c) Diseño de sondas. Mediante la herramienta earray (https://earray.chem.agilent.com/earray/), se diseñaron sondas para cada una de las categorías. Para cada grupo de sondas, se descartaron aquellas que no cumplían los criterios de calidad para hibridación cruzada (BC3 y BC4). Además para la categorías de genes no anotados, se descartaron algunas secuencias para ajustar el número total de sondas en el microarray teniendo en cuenta que se añadieron 1417 controles internos de Agilent y 400 sondas de replicados (40x10).  
 
 
Cuadro resumen de los unigenes por categoría  de sondas seleccionadas.
 
 
Total unigenes
Sondas  seleccionadas
Ficheros fasta
Diseño de sondas y datos fitrados
KEGGs_AUTOFACT
6.725
6.659
zipseg 1,3MB zipseg 3,2MB
KEGGs_B2G
885
878
zipseg 0,2MB zipseg 2,8 MB
GO_Term_F
12.561
12.457
zipseg 2,5 MB zipseg 3,7 MB
GO_Term_P
1.322
1.310
zipseg 0,3 MB zipseg 1,5 MB
GO_Term_C
1.172
1.158
zipseg 0.3 MB zipseg 1,4 MB
Unassigned proteins
3.331
3.270
zipseg 0,9 MB zipseg 2,2 MB
AUTOFACT_Annotated
6.282
6.172
zipseg 0,4 MB zipseg 2,3 MB
Non_annotated
11.691
11.497
zipseg 2,8 MB

NOTA: Para solicitar la clave de aquellos ficheros protegidos, escribir a: manuel.manchado@juntadeandalucia.es
 
En la siguiente tabla, se muestran los principales datos sobre el diseño final del arras. El microarray final incluyó un total de 45.220 sondas totales, de las que 43.403 eran sondas específicas de Solea senegalensis, 1.417 controles para la plataforma Agilent y 400 sondas que correspondían a 40 genes repetidos 10 veces. Los genes seleccionados y las sondas se pueden descargar aquí
  
Cuadro resumen del microarray desarrollado para expresión génica del lenguado.
 
Number of Microarrays per Slide
4
Number of Slides
1
Total Number of Features
45.220
Number of Agilent Controls
1.417
Number of Features Occupied by Replicate Probes
400
Percentage Filled by Selected Probe Groups
100%
 
 
 

 socios aquagenet 16may12