Edificada bajo el patronazgo de los Ponce de León en la primera mitad del siglo XVI en estilo gótico tardío con preludios de plateresco.La Iglesia de Nuestra Señora de la O es producto de varias transformaciones a lo largo del tiempo. Por esta razón, a la hora de su descripción hay que tener en cuenta dos zonas bien diferenciadas, que son: La nave central, de estilo gótico-renacentista, y las capillas añadidas, en su mayoría del siglo XVI.

A la nave central, que termina en un ábside poligonal de tres caras, se abren diversas capillas laterales, realizadas aprovechando los espacios entre contrafuertes. Se encuentra dividida en tres tramos por dos grandes arcos y a sus pies presenta una tribuna que sustenta el órgano que bloquea la entrada de luz por el óculo. La bóveda que lo cubre está formada por una complicada nervadura y tracerías flamígeras. En el presbiterio, elevado con respecto al resto de la nave, destacan cinco ventanales góticos. Desde él, a través de dos puertas, se accede a la sacristía y al cuarto de la plata.

A la nave central, como se ha dicho, se abren varias capillas, tres en el lado izquierdo y dos en el derecho:

-Capilla del Bautismo. Situada en al lado del Evangelio, atribuida su labra a Sebastián Bernal de Escobar (siglo XVI). Destacan la decoración de su portada, la verja de madera y el grupo escultórico de la Virgen de la Granada con el Niño.

-Capilla del Sagrario. Situada en el muro del Evangelio, es la más amplia. Es de estilo barroco y planta de cruz latina con cubierta de bóveda de cañón. Destacan los zócalos de azulejos sevillanos del siglo XVIII y las posteriores decoraciones que se le añadieron.

-Capilla de Nuestra Señora del Carmen. Situada en el muro del Evangelio, análoga en su construcción a la del Sagrario, era de menores dimensiones en origen, ampliándose posteriormente (1773).

-Capilla de Nuestro Padre Jesús Nazareno. Situada en el lado derecho, anteriormente se denominó de las Animas. De planta de cruz latina, tiene una verja en el arco de entrada. La cúpula del crucero se apoya sobre pechinas y se remata con una linterna. Posteriormente se le adosó un cuerpo para albergar el retablo. Destacan además del retablo, los azulejos de Triana (1755), realizados por Joseph de las Casas.

-Capilla del Rosario. Destaca una notable reja costeada por un emigrante de Rota en Perú (1632). La capilla presenta proporciones semejantes a la Sacramental, siendo la que más reformas ha sufrido. Los muros están revestidos por azulejos de Triana de 1800 aproximadamente.

Finalmente mencionaremos las dos sacristías, labradas en el muro de la Epístola, la pequeña espadaña que apoya sobre el pretil de la azotea que descansa en el muro del Evangelio y el reducto construido en 1703, que fue posteriormente modificado a comienzos de este siglo.
Entre otros elementos relevantes citaremos el Coro, con una sillería y tallas destacables. Es de dos pisos, obra de Andrés Martínez y Diego Roldán.

Exteriormente, la Iglesia presenta un aspecto muy sobrio. En la fachada principal se encuentra la portada de acceso al templo, situada a los pies. Está formada por un arco apuntado con arquivolta decorada con puntas de diamantes. Sobre ella, un matacán. Entre este elemento y la puerta hay un óculo. Obra del siglo XVI, que tuvo como objeto dotar de luz el interior del templo, función que perdió cuando se colocó el órgano. La parte superior del edificio está recorrido por un antepecho elevado que se interrumpe al llegar a la torre. Dicha torre, obra del siglo XVII, se reconstruyó posteriormente en 1744. Consta de dos cuerpos, albergando el superior las campanas. Un chapitel revestido de azulejos azules y blancos, procedentes del taller trianero de Diego Galán, cubre la torre.

A la izquierda de la portada se sitúa el cuerpo saliente que alberga el matacán con canecillos y que posiblemente sirvió para almacén de la maquinaria del reloj. Además de la greca de punta de diamante, el único elemento decorativo existente son las gárgolas en forma de animales.